Phân tích miễn dịch đã được thực hiện trên một cố định bằng formalin, parafin-nhúng mẫu cắt ở độ dày 4 mm. Mẫu vật khối paraffin được sử dụng trong các thí nghiệm hiện nay đã được bắt nguồn từ mô lưu trữ (không đại diện cho mẫu từ bệnh nhân đã đóng góp mẫu tươi) có nguồn gốc từ các bệnh nhân có phẫu thuật tại Trung tâm Y tế Samsung. Tất cả triệu chứng ung thư gan các slide được deparaffinized trong xylen, hydrat lại thông qua một loạt rượu được xếp loại, và rửa trong PBS. Các slide được điều trị bằng 0,3% hydrogen peroxide trong PBS trong 5 phút ở nhiệt độ phòng để dập tắt các hoạt động peroxidase nội sinh. Để thu hồi kháng nguyên, phần được microwave hai lần cho 10 phút trong 10 mM đệm citrate (pH 6,0). Đối với AGR2 nhuộm, đa dòng kháng huyết thanh thỏ chống lại peptide có nguồn gốc từ các chuỗi protein AGR2 (pha loãng 1: 250; Abcam) đã được sử dụng và các kháng thể chính được ủ ở 4 ℃ qua đêm. Như một điều khiển âm bản, phim hình cũng đã được xử lý mà không có kháng thể chính. Phát hiện được thực hiện bằng phương pháp streptavidin-biotin thường với 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride như một nhiễm sắc (DAKO, Copenhagen, Đan Mạch). Các slide được counterstained với hematoxylin trong 5 phút, sau đó khử nước bằng cách rửa tuần tự trong một loạt ethanol và rửa ba lần với xylene. Các slide sau đó đã được gắn kết với Lãnh-mount (Thermo Scientific, Waltham, MA).
Subcloning của AGR2 nhân
Trình tự mã hóa độ dài đầy đủ của AGR2 con người là PCR-khuếch đại sử dụng AGR2 mồi, như được mô tả dưới đây. Điều kiện đi xe đạp nhiệt bao gồm một bước ban đầu tại 95 ℃ trong 5 phút, tiếp theo là 20 chu kỳ ở 95 ℃ trong 1 phút, 55 ℃ trong 1 phút, 72 ℃ trong 2 phút, sau đó một phần mở rộng cuối cùng ở 72 ℃. Các mồi xuôi là 5'-GGGGAATTCATGGAGAAAATTCCAGTG-3 'và mồi ngược là 5'-GGGCTCGAGTTACAATTCAGTCTTGAG-3'. Khuếch đại độ dài đầy đủ AGR2 sau đó được subcloned vào EcoR1-Xho I-tiêu hóa động vật có vú vector biểu hiện pcDNA3.1 Myc-ông (Invitrogen). Trình tự của AGR2 trong vector động vật chữa trị ung thư phổi có vú đã được khẳng định bởi phân tích trình tự DNA.
Thời gian thực theo dõi tăng trưởng tế bào
Hiệu quả của AGR2 quá mức về tăng tế bào được đánh giá bằng thời gian thực hệ thống cảm biến điện tử (RT-CES; ACEA Biosciences, San Diego, CA), theo giao thức của nhà sản xuất. Điều khiển vectơ và ổn định 2.774 tế bào AGR2-biểu hiện tốt được cấy vào tấm cảm biến 96-tốt ở 2,5 × 10 3 tế bào mỗi giếng, sau đó ủ qua đêm. Các tế bào được theo dõi liên tục sử dụng RT-CES.
Trong ống nghiệm xét nghiệm di cư
Di cư của các tế bào ung thư buồng trứng được đánh giá bằng cách sử dụng một buồng matrigel Biocoat (Becton Dickinson cho phòng thí nghiệm, Bedford, MA), như được mô tả trước đây (Choi et al., 2005). Một thời gian ngắn, 1 × 10 5 tế bào được cấy vào từng giếng và buồng dưới cùng bên ngoài transwell đã được lấp đầy với 500 ml DMEM vừa bổ sung 1% BSA. Sau khi ủ trong 16 giờ, các tế bào được cố định ở 100% methanol trong triệu chứng bệnh ung thư phổi 5 phút và nhuộm màu trong 0,1% eosin. Số lượng tế bào di cư vào phía dưới của bộ lọc được tính.
VnVista I-Shine
© http://vnvista.com