Chúng tôi tiếp tục mở rộng nỗ lực của chúng tôi để thu thập huyết thanh của bệnh nhân ung thư buồng trứng nhầy và tình nguyện viên bình thường. Bởi vì AGR2 trước đây đã được báo cáo có liên quan đến khối u di căn, nó sẽ được thú vị để xác định vai trò của AGR2 trong sự tiến triển của khối u buồng trứng và di căn. Phân tích các protein AGR2 gợi ý sửa đổi protein tiềm năng mà có thể là quan trọng đối với chức năng AGR2 (Park và Lee, dữ liệu chưa công bố). Phân tích điều trị ung thư vú chức năng tiếp tục sửa đổi protein AGR2 trong sự tiến triển của khối u sẽ cung cấp thông tin cho ý nghĩa chức năng của nó, thêm vào vai trò của nó trong chẩn đoán. Gần đây AGR2 được phân loại như là một thành viên của isomerase protein disulfide (PDI) gia đình và hiển thị để đóng một vai trò đặc biệt trong việc sản xuất chất nhầy
Nuôi cấy tế bào
Ung thư ở người buồng trứng (2774 tế bào) và người biểu mô bào thai thận tế bào (HEK 293 tế bào) được nuôi cấy trong DMEM và EMEM, tương ứng, và bổ sung 10% FBS và thuốc kháng sinh (penicillin [100 đơn vị / ml] và streptomycin [100 microgam / ml ]; Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) trong một bầu không khí làm ẩm 5% CO 2 ở 37 ℃.
Mô và protein huyết thanh chuẩn bị
Tất cả các mẫu mô và huyết thanh của người được thu thập với chính thể chế ở Trung tâm y tế Samsung. Tất cả các mô buồng trứng, trong đó có nguồn bình thường và khối u, được thu thập từ những người phụ nữ đã trải qua phẫu thuật tại Khoa sản và phụ khoa tại Trung tâm y tế Samsung. Các mẫu mô được ngay lập tức được lưu trữ trong nitơ lỏng và bảo quản ở -80 ℃ đến khi phân tích. Lưu trữ Paraffin từ Sở Pathology của Trung tâm Y tế Samsung đã được sử dụng để xác nhận sự biểu hiện của AGR2 bởi mô miễn dịch. Tất cả các mẫu huyết thanh được lấy tĩnh mạch của bệnh nhân từ các nhà tài trợ và khỏe mạnh. Sera từ phụ nữ bị ung thư buồng trứng được thu thập trước khi phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng. Cả hai giai đoạn và mô học của ung thư được xác định bằng các phương pháp tiêu chuẩn bệnh lý. Serum đã được tách, ly tâm (3000 × g, 20 phút), và được lưu trữ ở -80 ℃ trong 50 ml dung dòch cho đến khi sử dụng. Mẫu huyết biểu hiện ung thư buồng trứng thanh được sử dụng để phát hiện các protein huyết thanh cấp AGR2 bằng phân tích Western blot sau khi suy yếu albumin và IgG từ mẫu huyết thanh bằng cách sử dụng một Vivapure chống HAS / IgG kit (Sartorius Stedim Biotech, Bohemia, NY) theo giao thức của nhà sản xuất.
Hóa học
Kháng thể chống lại AGR2 được mua từ Abnova (clone 1C3; thành phố Đài Bắc, Đài Loan) và Abcam (thỏ polyclonal; Cambridge, Vương quốc Anh). Tubulin và lamin B được mua từ Santa Cruz Công nghệ sinh học, Inc (Santa Cruz, CA), và β-actin từ Sigma (St. Louis, MO). 4 ', 6-diamidio-2-phenylindole (DAPI) đã được mua từ Roche Khoa học Ứng dụng (Mannheim, Đức). Tất cả các thuốc thử hóa học khác được mua từ Sigma, trừ khi có chỉ định khác.
Thâm chuyển ổn định và tạo ra các tế bào buồng trứng của người AGR2-biểu hiện tốt
2.774 tế bào ung thư buồng trứng của người đã thoáng transfected với điều khiển vector hoặc vector AGR2 biểu lộ bằng Effectene (Qiagen, Hilden, Đức) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, năm 2774 tế bào được cấy vào ngày trước khi thâm chuyển, sau đó ủ cho đến khi đạt 60% hợp lưu vào ngày thâm chuyển. Sau khi lựa chọn trong môi trường có chứa G418 (500 mg / mL; Invtrogen), thuộc địa rời rạc G418-kháng thuốc được chọn để mở rộng hơn nữa trong môi trường chọn lọc. Một số dòng vô tính cho điều khiển vector và 2774 tế bào AGR2-biểu hiện tốt được duy trì với DMEM chứa G418.
RNA cô lập, phân tích microarray cDNA, và RT-PCR
Tổng số RNA tế bào được chiết xuất từ các khối u buồng trứng và các mô bình thường phù hợp thu được từ 32 bệnh nhân sử dụng thuốc thử TRIZOL (Invitrogen Cuộc sống Technologies), theo giao thức của nhà sản xuất. Nhân 17K cDNA microarray (Genomictree, Daejeon, Hàn Quốc) có chứa 17.075 cDNA của con người đại diện cho 15.724 gen khác nhau (Uni-Gene cụm) đã được sử dụng trong phân tích biểu hiện gen, như được ung thư vú nam mô tả trước đây ( Yang et al., 2003). Tóm lại, mỗi 50 mg tổng RNA được trộn với 2 mg oligo- (dT) 24 (GenoTech, Daejeon, Hàn Quốc) và ủ ở 65 ℃ trong 10 phút. Sợi đơn cDNA được tổng hợp trong sự hiện diện của Cy3-dUTP hoặc Cy5-dUTP (mỗi 1 mM, NEN Khoa học đời sống sản phẩm, Boston, MA) tại 42 ℃ trong 2 h. Tổng số RNA từ các khối u buồng trứng và các mô buồng trứng bình thường được dán nhãn Cy5 và Cy3, tương ứng. Cả hai Cy5- và Cy3-dán nhãn cDNA được tinh sạch bằng phương pháp PCR bộ lọc (Qiagen) và lai lên 17K microarray cDNA của con người. Các mảng được ủ ở 42 ℃ cho 16 h trong buồng lai ẩm.
VnVista I-Shine
© http://vnvista.com