Microarray lai được chụp bằng cách sử dụng ung thư

Microarray lai được chụp bằng cách sử dụng máy quét Axon 4000B (Molecular Devices, CA). Các tín hiệu và nền cường độ huỳnh quang được tính cho mỗi đầu dò bằng trung bình cường độ của mỗi điểm ảnh bên trong khu vực thăm dò tại chỗ sử dụng GenePix Pro 4.0 phần mềm (thiết bị phân tử). Điểm chất lượng kém hoặc không thể phân  biệt  ung thư gan các mức tín hiệu từ nền đã được loại trừ. Bình thường hóa dữ liệu và lựa chọn của các gen theo kiểu khác bày tỏ được thực hiện bằng cách sử dụng GeneSpring 7.3.1 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Để phân tích gen kiểu khác hiện giữa khối u và ghép mô buồng trứng bình thường, "mô hình lỗi gen chéo cho lần nhắc lại" đã được sử dụng. Dữ liệu biểu hiện gen đã được bình thường hóa bằng cách sử dụng bình thường LOWESS toàn cầu. Đầu dò mà đã được thay đổi tỷ lệ ≥ 2,0 lần giữa khối u và kiểm soát mô buồng trứng bình thường đã được lựa chọn và được xem như là thăm dò theo kiểu khác, bày tỏ. Đối với phân tích RT-PCR, 1 mg tổng RNA được hòa tan trong nước cất, sau đó sử dụng để tổng hợp cDNA bằng superscript sao chép ngược (RT; Invitrogen), sau đó khuếch đại PCR được thực hiện với mồi AGR2 cụ thể như sau: 94 ℃ trong 3 phút , tiếp theo là 20 chu kỳ ở 94 ℃ trong 30 s, 55 ℃ trong 30 s, và 72 ℃ trong 1,5 phút. Các mồi sau đây đã được sử dụng để khuếch đại PCR: mồi xuôi, 5'-GGGATGGAGAAAATTCCAGTG-3 '; và mồi ngược, 5'-GGGTACAATTCAGTCTTCAG-3 '. Sản phẩm PCR được phân cách bằng 1,2% agarose gel điện di. GAPDH đã được sử dụng như là một tải kiểm soát.

Phân đoạn dưới tế bào

Phân đoạn dưới tế bào được thực hiện bằng cách sử dụng  dấu hiệu ung thư gan một bộ ProteoExtract dưới tế bào Proteome Extraction (Calbiochem, Darmstadt, Đức). Tế bào nuôi cấy đã được thu hoạch với 500 ml của tế bào lysis buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 10 mM NaCl, 1 mM KH 2 PO 4, 5 mM NaHCO 3, 1 mM CaCl 2, và 0,5 mM MgCl 2) với một cocktail protease inhibitor (Roche Diagnostics Corp Penzberg, Đức). Các tế bào được phép sưng lên trong 5 phút, sau đó đồng nhất 50 lần sử dụng một đồng hóa Dounce (Wheaton, Millville, IL). Lysates được ly tâm trong 10 phút ở 7500 rpm trong một máy ly tâm tại 4 ℃, và phần tế bào chất được chuyển vào ống nghiệm sạch. Các viên hạt nhân đã được rửa sạch một lần với tế bào ly giải đệm trước khi resuspending với SDS-loading buffer. Hiệu quả của phân đoạn dưới tế bào đã được khẳng định bởi phân tích Western blot với kháng lamin B và anti-tubulin là kháng thể đánh dấu protein hạt nhân và tế bào chất, tương ứng.

Phân tích Western blot

Tế bào và lysates mô cấy được ly giải bởi sonication trong đệm phosphat mặn với Ripa đệm (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% sodium deoxycholate, và 0,1% SDS) chất ức chế protease có chứa ( hỗn hợp chất ức chế protease, Roche Khoa học ứng dụng), như được mô tả trước đây ( Công viên et al., 2005).Protein được tách bằng SDS-PAGE và electrophoretically chuyển lên một ECL nitrocellulose màng (GE Healthcare, London, Vương quốc Anh). Phân tích Western blot được thực hiện với các kháng thể chính (1: 1000 hoặc 1: 2000 pha loãng) và một hệ thống Chemiluminescence nâng cao (ECL; Amersham Khoa học, Chicago, IL).

Gián tiếp nhuộm miễn dịch huỳnh quang và kính hiển vi cùng tiêu điểm

Các tế bào được trồng trên coverslips kính tiệt trùng, cố định với 4% paraformaldehyde trong 0,1 M phosphate buffer trong 15 phút, sau đó bị chặn với 0,1% BSA trong PBS. Sau đó, các tế bào được ủ với anti-AGR2 (1: 500 pha loãng) trong PBS, tiếp theo ung thư phổi  là ủ với kháng thể thứ cấp 488 Alexa liên hợp (1: 5000 pha loãng; Vector, Burlingame, CA). Các slide được rửa ba lần với PBS, và gắn kết trong lắp phương tiện truyền thông (Vectorshield; Vector). Hình ảnh đã được chụp bằng kính hiển vi đồng tiêu Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).